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jueves, enero 26, 2006

 

Detección y Localización Celular de Secuencias de ARN Enteroviral en la Médula Espinal de Pacientes con Esclerosis Lateral Amiotrófica

NEUROLOGIA

TITULO : "Detección y Localización Celular de Secuencias de ARN Enteroviral en la Médula Espinal de Pacientes con Esclerosis Lateral Amiotrófica."

AUTOR : Berger MM, Kopp N, et al.

CITA : Neurology 54:20-25, Ene 2000.

REVISTA : [Detection and Cellular Localization of Enterovirus RNA Sequences in Spinal Cord of Patients with ALS]

MICRO : Aunque se detectó ARN de enterovirus no poliovirus en cortes de médula espinal de pacientes con esclerosis lateral amiotrófica, resta por demostrar el posible mecanismo patogénico de estos microorganismos.

RESUMEN

Introducción.

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA), señalan los autores, es una enfermedad de las neuronas motoras (ENM) que produce una destrucción gradual de estas células y lleva a una debilidad progresiva y a la parálisis muscular, y eventualmente a la muerte por insuficiencia respiratoria. Si bien se han propuesto diversas hipótesis, la etiología de la ELA sigue siendo desconocida. Aunque no se ha aislado ningún virus de muestras neurológicas y no se ha identificado una respuesta inmune específica, algunos investigadores han detectado secuencias de enterovirus en el líquido cefalorraquídeo de algunos pacientes con ELA. Notablemente, existen evidencias experimentales de que algunos virus pueden causar una ENM en ratones. El objetivo del presente estudio fue determinar si es posible detectar secuencias genómicas de enterovirus en muestras histológicas de pacientes con ELA mediante el uso de técnicas de biología molecular.

Métodos

Se utilizaron en el estudio muestras de médula espinal fijadas en formol correspondientes a 17 casos de ELA y 29 casos de otras enfermedades neurológicas (incluyendo 6 casos de enfermedad de Creutzfeld-Jakob, 3 de espina bífida, etc.). Se utilizaron 2 técnicas de transcripción inversa acoplada a reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) diseñadas para detectar un segmento altamente conservado de la región 5' no traducida del EV. En un caso se utilizó la metodología clásica y en el otro se realizó la reacción in situ. En la RT-PCR clásica, las secciones histológicas fueron desparafinadas y tratadas con proteinasa-K antes de iniciar la transcripción inversa. El producto de la PCR fue analizado mediante electroforesis en gel de agarosa y los fragmentos extraídos del gel fueron sometidos a secuenciación nucleotídica. Para la RT-PCR in situ, las muestras fueron desparafinadas y fijadas en paraformaldehido antes de la transcripción inversa. Durante la PCR se incorporaron nucleótidos marcados con digoxigenina, cuya presencia en las muestras fue revelada luego con anticuerpos específicos marcados con fosfatasa alcalina. Las muestras fueron analizadas por microscopía óptica.

Resultados

La RT-PCR in situ resultó positiva en 15 (88.3%) de las muestras de ELA y la RT-PCR clásica fue positiva en 13 casos (76.4%). Con la primera técnica, la microscopía demostró que los productos de PCR se localizaban en el citoplasma de un único tipo celular del cuerno anterior medular. Estas células fueron identificadas como neuronas de acuerdo a su morfología, pero no puedo hacerse una tinción doble para confirmar la identidad de las mismas. Las secuencias de los productos purificados en las 13 RT-PCR clásicas que resultaron positivas diferían entre sí, pero las discrepancias en homología no superaban el 15%. La secuencia consenso de los productos de PCR exhibió un 94% de homología con el ecovirus 7 y un 90.4% con el ecovirus 6. La RT-PCR in situ fue negativa en 28 de los 29 casos analizados y la técnica clásica lo fue en 22 de los 23 casos en los que fue aplicada; los casos positivos correspondieron a un pinealocitoma anaplásico grado III y un cáncer de garganta con metástasis en ganglio linfático, respectivamente. Las 6 muestras de enfermedad de Creutzfeld-Jakob no pudieron ser procesadas por RT-PCR clásica.

Discusión

En el presente estudio, señalan los autores, se detectó ARN de enterovirus en muestras histológicas de médula espinal de pacientes con ELA. Las muestras fueron positivas por RT-PCR in situ en el 88.3% y por RT-PCR clásica en el 76.4% de los casos. Además, esta investigación demostró por primera vez que estas secuencias enterovirales pueden localizarse en los cuerpos neuronales de los cuernos anteriores de la médula. Aunque no fue posible realizar una tinción doble de las células positivas, aclaran, el tamaño y la forma de los citoplasmas teñidos sugieren fuertemente que esas células son neuronas. Estos resultados constituyen una fuerte evidencia de la relación entre la presencia de enterovirus en las neuronas y el desarrollo de ELA. Sólo el 3.3% de los controles sin ELA fueron positivos por RT-PCR in situ, lo cual indica que es improbable encontrar secuencias de enterovirus en el sistema nervioso de estos individuos. Se ha informado la persistencia a largo plazo del ARN enteroviral en distintos tejidos, comentan, y se ha sugerido la posible participación de estos virus en enfermedades tales como la diabetes mellitus, la miocarditis crónica y el síndrome de fatiga crónica. Los productos de PCR secuenciados en el presente estudio mostraron homología con enterovirus no poliovirus de conocido neurotropismo (ecovirus 7 y 6). Aunque la detección de secuencias enterovirales en los pacientes con ELA relaciona a la enfermedad con la persistencia de enterovirus, no aporta indicios sobre el mecanismo que lleva a la destrucción de la neurona motora. Por el momento, advierten los autores, no hay evidencias de que el virus detectado esté involucrado de alguna manera en la muerte neuronal y en el curso de la enfermedad. Es necesario ampliar las investigaciones para confirmar que el virus detectado es patogénico y determinar cómo se produce la infección persistente con el mismo.

Redactor Ejecutivo : Dr. Pablo Baldi

Sociedad Iberoamericana de Información Científica

Ref : INET , SAMET , NEURO

Fuente: http://www.bago.com/Neurolred/neuro98web.asp



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